OBSERVACIÓN PREPARADAS EN FRESCO

MATERIAL

- Lancetas
- Algodón
- Portaobjetos
- Microscopio
- Alcohol

PROCEDIMIENTO

1. Comenzar por desinfectar la zona a puncionar con la lanceta.

2. Dispensar la sangre en el portaobjetos previamente desengrasado.

3.Observar al microscopio ( condensador bajo y diafragma abierto).

















OBSERVACIÓN

PRÁCTICA 18: DETERMINACION MANUAL DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN

FUNDAMENTO 

Es una prueba que mide la rapidez con que sedimentan los hematíes de una muestra de sangre que ha sido tratada con citrato sódico al 3.8%.

Cuando esta sangre se coloca en tubo vertical va a estar sometida a fuerzas gravitatorias y eléctricas que resultan de la interacción del plasma con las células, y es la VSG la que pone de manifiesto las características físicas de la sangre.

En condiciones normales es un proceso lento, pues la fuerza con que es atraído cada hematíe hacia el fondo del tubo es casi compensada por la fuerza  ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba.

MUESTRA

Sangre venosa anticoagulada con citrato sodico al 308% en proporción 4:1.

MATERIAL

- Pipeta de Westergreen

- Soporte para VSG.

TÉCNICA

1. Se mezcla suavemente la sangre y el anticoagulante contenido en el tubo, haciéndo inversiones suaves.

2. Situamos el tubo mezclador en una de las perforaciones de la base de la gradilla para VSG.

3. Se introduce la pipeta de VSG a través de las perforaciones de la gradilla, presionamos con la pipeta sobre el tapón del tubo hasta que su punta lo perfore y alcance el fondo del tubo , llenar con la ayuda del émbolo que tiene cada una de ellas. 

4. Dejar reposar la sangre durante una hora apuntando los mm que ha bajado la columna de hematíes.

Resultados :

Se expresa en mm/h.

ÍNDICE DE KATZ= a+b:2/2

Donde a= VSG 1 hora.

b= VSG 2 hora.

Valores normales:

Hombres: 4-14mm/h.

Mujeres: 6-20mm/h.

PRÁCTICA 17: DETERMINACIÓN ASLO INHIBICIÓN HEMÓLISIS

SIGNIFICADO CLÍNICO DE ANTICUERPOS ANTIESTREPTOLISINA

El título de antiestreptolisinas ASLO es la medición de

 anticuerpos anti-Estreptococo betahemolíticos del tipo A

. Esta bacteria produce una enzima llamada estreptolisina O

, que puede destruir los hematíes y el cuerpo reacciona 

contra ella produciendo anticuerpos específicos 

antiestreptolisina O.

La medición de estos anticuerpos es lo que refleja el análisis

 de antiestreptolisinas O ó ASLO.

Para qué se realiza la prueba

La presencia de títulos altos de antiestreptolisinas O ó 

ASLO, indican una infección por la bacteria Estreptococo 

betahemolíticos del tipo A, que puede producir una 

glomerulonefritis, una fiebre reumática, una endocarditis 

bacteriana o una escarlatina.

La elevación de ASLO aparece a la semana de la infección 

por el estreptococo, los valores más elevados se dan en la

 tercera semana de la infección y es cuando pueden 

aparecer las enfermedades secundarias a esta infección

 (glomerulonefritis, una fiebre reumática, una endocarditis

 bacteriana o una escarlatina) pero no son específicos de

 ninguna de ellas. Deben ser diagnosticadas cada una de

 ellas por la clínica o por otros estudios diagnósticos.

El ASLO pueden mantenerse elevado a los 6 meses en el 

30% de los casos.

Procedimiento de obtención

Para realizar este análisis NO se precisa estar en ayunas.

Los niveles de ASLO pueden ser enmascarados por los 

antibióticos y por los corticoides. También un aumento de la

 betalipoproteína puede inhibir la estreptolisina O y producir

 títulos falsos de elevación de ASLO.

Niveles normales de antiestreptolisinas O (ASLO)
en adultos	Menores de 160 Unidades/ml
en niños menores de 2 años	Menores de 50 Unidades/ml
en niños entre 2 y 4 años	Menores de 160 Unidades/ml
en niños entre 4 y 12 años	Entre 160 y 300 Unidades/ml

MATERIAL:

- Hematíes 3%.

- Placas microtiter V.

- Micropipetas.

- Puntas de pipeta.

- Gradillas.

- Suero humano.

- Solución tampón fosfato..

- Papel parafilm.

- Horno cultivo.

- Tampón 6.5 pH.

Procedimiento

1.Lavar 3 veces eritrocitos humanos grupo O con PBS (también puede utilizarse eritrocitos de conejo). Resuspender 0,5 ml de eritrocitos empacados en un tubo con 9,5 ml del amortiguador1 , para obtener una suspensión aproximadamente al 5%.

2.Obtener una muestra de suero e inactivarlo a 56°C por 30 min. El suero puede conservarse hasta 1 día en refrigeración. Correr una alícuota de un suero control con cada grupo de muestras.

3.Preparar las diluciones del suero.

4.Reconstituir la toxina reducida y liofilizada apenas antes de usarla, con el amortiguador, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5.Para cada muestra, preparar una serie de tubos según el siguiente cuadro:

6.Mezclar suavemente e incubar a 37°C por 15 min para que ocurra la neutralización (si hay anticuerpos en la muestra).

7.Agregar 0,5 ml de la suspensión de eritrocitos a cada tubo, mezclar suavemente e incubar a 37°C por 45 min, resuspendiendo cada 15 min.

8.Centrifugar los tubos por 5 min a 800 xg y observar cuál es el último tubo (máxima dilución) en el cual no hay ningún grado de hemólisis. Este se toma como punto final de la prueba, la cual se puede expresar como título, o como unidades Todd (tienen el mismo valor numérico).

Observaciones adicionales

 El tubo control de eritrocitos (control negativo) debe tener un sobrenadante completamente claro y el tubo control de la toxina (control positivo) debe quedar lisado, para que la prueba sea técnicamente válida. Además, la muestra control debe resultar dentro de los límites del valor esperado. Se considera una seroconversión significativa cuando el aumento del título es de más de 2 diluciones, aún en títulos bajos. Los títulos elevados (>250 U Todd) o las seroconversiones significativas, sugieren una infección reciente. En algunas enfermedades hepáticas, el aumento de ciertas β-lipoproteínas que inhiben la toxina puede causar resultados falsamente positivos. En pacientes con trastornos hepáticos se debe verificar los resultados con otras pruebas serológicas para la detección de anticuerpos antiestreptocóccicos.

En resumen: 

1. Reconstituímos el suero y la estreptolisina con agua destilada.

Control+ reactivos : suero del paciente, hematíes 3% + Tampón y SLO ( toxina)

2. Diluímos 200 uL de suero + 1800uL de tampón ( 1/10)

Dilución 100uL suero + 2400uL tampón ( 1/25).

3. Echamos tampón en la placa microtiter.

4. Dispensamos suero 1/10 en la fila A ( haciéndo una dilución seriada), y no echar en el pocillo nº 12

5. Volvemos a hacer lo mismo con suero ( 1:25) en la fila B, y tampoco echar en el pocillo nº 12.

6. Depositamos 25 uL de disolución de estreptolisina en todos los pocillos menos en el 12 de la fila B.

7. Agitar e incubar durante 15 minutos/37ºC.

8. Depositar  25uL de suspensión de hematíes (B).

9. A continuación dispensar 25 uL de hematíes en todos los pozos.

10. Agitar suavemente e incubar 45min/37ºC, agitándo después de los primeros 15 minutos.

RESULTADO

TÍTULO A: 9

TÍTULO B: 8

RECUENTO DE PLAQUETAS

FUNDAMENTO

Las plaquetas son los elementos formes más pequeños de

la sangre. Actúan en la hemostasis y en el mantenimiento

 de los vasos sanguíneos.

Dado su pequeño tamaño son muy difíciles de contar. El 

líquido de SPINREACT facilita la visualización y contaje 

microscópico óptimo de las plaquetas al dotarlas de una

 refringencia, evitándo, al mismo tiempo, su adherencia a 

otros elementos, así como su agregación

MUESTRA 

Se puede utilizar sangre capilar o venosa recién extraída

 en un tubo con EDTA.

MATERIAL

- Cámara de Neubauer

- Microscopio 

- Agua destilada

- Sangre con anticoagulante

- Micropipeta automática

- Puntas de pipeta 

- Algodón 

- Placa de Petri

PROCEDIMIENTO

1. Añadir al tubo de reactivo 20 uL ( 0.02mL) de sangre

 total. Agitar bien.

2. Llenar la cámara de Neubauer. Evitar la formación de 

burbujas. 

3.Dejar la cámara 15 minutos para asegurar la 

sedimentación completa de las plaquetas.

4. Empleando una óptica de mediano aumento y el

 condensador ligeramente bajo, contar la totalidad de las 

plaquetas contenidas en el cuadrado grande (1mm2).

Estas aparecen como corpúsculos refringentes

 perfectamente diferenciados de los leucocitos y restos de

 estroma eritrocitarios.

CÁLCULOS

Nº  de plaquetas contadas x 1000 = plaquetas/ mm3 de

 sangre.

  

VALORES NORMALES

150.000- 400.000 plaquetas/mm3

En las cámaras de Neubauer más usuales 1 mm2 equivale a:

- Thoma: 1 cuadro grande = 16 medianos.

- Neubauer antigua:  1 cuadro grande = 16 medianos.

- Neubauer mejorada: 1 cuadro grande= 25 medianos.

Resultado final expresado en mm3.

PRÁCTICA 16: EASY RID

DESCRIPCIÓN

EASY RID son placas de 12 pozo para la determinación cuantitativa e inmunodifusión radial de las plasmaproteínas humanas, en el suero, plasma y otros líquidos biológicos.

https://www.youtube.com/watch?v=ko3cCY2EHHg

MATERIAL

- Placa de agarosa.

- Micropipeta automática

- Puntas de pipeta

- Suero

- Agua destilada

- Algodón

COMPOSICIÓN

EASY RID contiene, en un estrato de gel de agarosa, el antisuero monoespecífico producido inmunizando conejos o cabras.

PROCEDIMIENTO DEL TEST

1. Extraer la placa EASY RID de su sobre, abrirla y dejarla unos 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la evaporización de eventuales  gotitas de agua de condensación en los pozos.

2. Aplicar con pipeta de precisión 5 uL de la muestra cuya concentración de la plasmaproteína se quiere determinar siguiendo las indicaciones .

3. Dejar absorber por unos 20', cerrar la placa con su tapa y volcar; guardar la placa en su sobre y dejarla en un plano, a temperatura ambiente, por 48 horas.

INTERPRETACIÓN 

Medir con la regla al efecto o con lente de medición, e diámetro de los halos en mm. Leer en las tablas adjuntas según el diámetro de los precipitados , el valo de la concentración de proteína.

Importante:

En esta técnica el pipeteo es reverso, es decir, cogemos la mayor cantidad y luego dispensamos apretando la pipeta automática hasta el primer tope.

La vida media de las placas de agar es de 6 meses.

Rango de la placa desde 39.6-512.7

Para el desarrollo de esta práctica hemos utilizado una placa de tres colores, los cuales cada uno corresponde a un determinada plasmaproteína.

Color rojo ( Ig A), verde( Ig G) y azul ( Ig M)

RESULTADO

1.Inmunoglobulinas G (verde):

• pocillo 1 = 8 mm = concentración: 2650 mg/ dL
• pocillo 2 = no se puede calcula ya que esta desplazado
• pocillo 3 = 5 mm = concentración: 700 mg/ dL
• pocillo 4 = no se puede calcular ya que esta desplazado

2. Inmunoglobulinas A ( Rojo):

• pocillo 1 = +9'3 mm = concentración: superior a 634 mg/ dL
• pocillo 2 =  6 mm = concentración: 210 mg / dL
• pocillo 3 = 4 mm = concentración: 42 mg/ dL
• pocillo 4 = 5 mm = concentración: 118 mg/ dL

3. Inmunoglobulinas M (azul) :

• pocillo 1 = 9 mm = concentración: 449 mg/ dL
• pocillo 2 = 6 mm = concentración: 160 mg/ dL
• pocillo 3 = 4 mm = concentración: 32'1 mg/ dL
• pocillo 4 = 3'9 mm = concentración: 27 mg/ dL

PRÁCTICA 15 PCR- LATEX ( AGLUTINACIÓN EN PORTA)

PRINCIPIO DEL METODO

La PCR-Látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de PCR en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-PCR humana son aglutinadas por moléculas de PCR presentes en la muestra del paciente.

SIGNIFICADO CLINICO
La Proteína C-reactiva es una proteína de fase aguda, presente en el
suero de pacientes sanos, la cual puede incrementarse
significativamente en la mayoría de procesos infecciosos bacterianos y virales, tejidos dañados, inflamación y neoplasias malignas. El incremento de concentración de esta proteína se produce después de unas horas de desarrollarse la inflamación pudiendo alcanzar niveles de 300 mg/L en 12-24 horas.

REACTIVOS
 Látex Suspensión de partículas de látex cubiertas de IgG de
cabra anti-PCR humana, pH, 8,2. Azida sódica 0,95 g/L.
 Control + Tapón rojo 
Suero humano con una concentración de PCR > 20
mg/L. Azida sódica 0,95 g/L.
 Control - Tapón azul Suero animal. Azida sódica 0,95 g/L.

PRECAUCIONES
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

CALIBRACION
La sensibilidad del reactivo de látex está estandarizada frente el Material de Referencia CRM 470/RPPHS.

CONSERVACION Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit están listos para el uso, y son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, y se evita la contaminación durante su uso. No congelar: la congelación de los reactivos altera irreversiblemente la funcionalidad de éstos.
Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y
turbidez.

MATERIAL ADICIONAL

- Agitador mecánico rotatorio de velocidad regulable a 80-100 r.p.m.

MUESTRAS
Suero fresco. Estable 8 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes de la prueba.
No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.

PROCEDIMIENTO

Método cualitativo
1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.
2. Depositar 50 µL de la muestra (Nota 1) a ensayar y una gota de
cada uno de los controles Positivo y Negativo, sobre círculos
distintos de un porta.
3. Homogeneizar suavemente el reactivo de PCR- látex antes de
usar. Depositar una gota (50 µL) junto a cada una de las gotas
anteriores.
4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.
5. Situar el porta sobre un agitador rotatorio a 80 – 100 r.p.m. y agitar durante 2 minutos. El exceso de tiempo puede originar la aparición de falsos positivos. 


Método semicuantitativo

1. Realizar diluciones dobles de la muestra en solución salina 9 g/L.
2. Proceder para cada dilución, como en la prueba cualitativa.

LECTURA E INTERPRETACION
Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente después de retirar el porta del agitador. La presencia de aglutinación indica una concentración de PCR igual o superior a 6 mg/L (Nota 2 y 3).
En el método semicuantitativo, se define el título como la dilución
mayor que da resultado positivo.

CALCULOS
La concentración aproximada de PCR en la muestra del paciente se
obtiene aplicando la siguiente fórmula:
 6 x Título de PCR = mg/L

CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar la funcionalidad del reactivo de látex, así como modelo de comparación para la interpretación de los resultados.

VALORES DE REFERENCIA
Hasta 6 mg/L. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DEL METODO
1. Sensibilidad analítica: 6 (5-10) mg/L, en las condiciones descritas en el ensayo.
2. Efecto prozona: No se observa efecto prozona hasta valores de
1600 mg/L.(Nota 1).
3. Sensibilidad diagnóstica: 95,6 %.
4. Especificidad diagnóstica: 96,2%.

INTERFERENCIAS
Bilirrubina (20 mg/dL), hemoglobina (10 g/L) y los lípidos (10 g/L) no interfieren. Factores reumatoides (100 UI/mL), interfieren. Otras
sustancias pueden interferir.
.
NOTAS
1. Una concentración muy elevada de PCR en la muestra del
paciente puede dar lugar a un resultado falsamente negativo
debido al efecto prozona. Se recomienda re-ensayar la muestra
utilizando un volumen de 20 µL.
2. La intensidad de la aglutinación no es indicativa de la
concentración de PCR en las muestras ensayadas.
3. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los
resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al

mismo tiempo los datos clínicos del paciente. 

En resumen, nuestro objetivo es determinar la existencia de PCR en suero humano. 
El suero utilizado está liofilizado por lo que se reconstituye con agua destilada ( 1 mL).
El reactivo utilizado ( látex) es el que lleva adherido el anticuerpo.

RESULTADOS:

En la primera tarjeta: Aglutinación en el test y control + y

 sin aglutinación en el control -

En la segunda tarjeta: Aglutinación en 1:2 y 1:4 y sin

 aglutinación 1:8, 1:16, 1:32; 1:64

Por lo tanto, el titulo es 1:4.

Concentración aproximada de PCR = 6 X 4 = 24 mg/ L
.
Por turbidimetria la concentración de PCR = 49 mg/ L.