PRÁCTICA 14: INMUNOTURBIDIMETRÍA CUANTIFICACIÓN DE Ig G POR INMUNOTURBIDIMETRIA

FUNDAMENTO

Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.

La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.

- La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a travésde una suspensión de partículas utilizando para ello un

espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido  sulfosalicílico).

- La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz

emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º).

Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se

ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele

utilizar para concentraciones más diluidas.

MATERIAL Y REACTIVOS

- Diluyente ( R1): Azida sódica 0.95g/L.
- Anticuerpo ( R2): anti-Ig G humana.
- Baño termostático ( 37ºC).
- Espectofotómetro ( 600nm)
- Suero o plasma sanguíneo recogido con heparina o EDTA.
- Gradilla
- Calibrador (PROT CONTROL)

PROCEDIMIENTO:

1. Calentar los reactivos y el fotómetro.

2. Ajustar el espectofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta:
- Muestra o calibrador : 10ul.
4. Mezclar y leer la absorbancia ( A), después de la adición de la muestra.
5. Inmediatamente después pipetear en la cubeta:
- Reactivo R2.
 6. Mezclar y leer la absorbancia detalladas la mayoría de analizadores automáticos del mercado.

CURVA DE CALIBRACIÓN

Procedimiento muestras problemas:

Diluciones problema: 1/10 y 1/100

1/10: 90ul suero salino y 10ul reactivo
1/100: reactivo 10ul y 190 ul solución salina

- Al depositar el reactivo 2 dejamos reposar 2 min. Medimos en el espectofotómetro ( A2-A1) proporcional a la concentración.
Realizamos curva.
Muestras problema:

- Depositamos 90ul ( solución salina) y 10 ul reactivo.
- Depositamos 10ul de reactivo y 190 ul de solución salina.
 Por último atemperamos y echamos reactivo 2 ( 200ul).

RESULTADO MEDICIÓN ESPECTOFOTÓMETRO:
- 0.041 A- 1/20
- 0.286 A - 1/10

concentración de calibrador = 2780mg/L x factor de dilución

Dilución 1 = 2780 x 0 =0 mg/L
Dilución 2= 2780 x 0.1= 278 mg/L
Dilución 3= 2780 x 0.25= 695 mg/L
Dilución 4= 2780 x 0.5= 390 mg/L
Dilución 5= 2780 x 0.75= 2085mg/L
Dilución 6= 2780 x 1= 2780 mg/L