DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS

FUNDAMENTO

La peroxidasa son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado.
Entonces el donador se oxida y se transforma en un colorante  insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse como indicador de la correspondiente actividad de la peroxidasa.

MATERIALES

R1
R2
R3

PROCEDIMIENTO
 Fijación de los frotis sanguíneos o de médula ósea secados al aire en la mezcla fijadora.
Enjuagar con agua corriente del grifo.
Secar al aire.
Reactivo 1 contiene total de frasco.
Etanol 15mL
Disolver reactivo 1 en etanol y añadirlo a una cubeta de 60 mL según Hellendahl.
Añadir agua destilada resolviendo 45mL.
Añadir rectivo 2 revolviendo : 10gotas.
Añadir reactivo 3 revolviendo : 2 gotas.

TINCIÓN:
Portaobjetos con frotis fijado.
Introducir en solución de tinción recién preparada durante 10 min.
Enjuagar con agua destilada durante 10 segundos.
Secar al aire.
Tinción ulterior  con hemalumbre en solución según Mayer durante 2 min.
Enjuagar con agua corriente del grifo de 3-5 min.
Secr al aire.

RETICULOCITOS

FUNDAMENTO

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen, como su nombre indica, un retículo o red cromatínica formada por restos de ARN , mitocondrias y otros órganos celulares.
Su cantidad en sangre periférica es un reflejo de la actividad eritropoyética medular.

Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vitales, azul de metileno nuevo o azul de cresi brillante. Estos colorantes dann lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.

MATERIALES

Microscopio óptico
Tubos de hemólisis
Pipetas de Pasteur
Portas
Baño maría
Sistema de filtración

REACTIVOS
Azul de cresil brillante en polvo
Solución salina al 0.9%
Citrato sódico al 3%
Agua destilada
Aceite de inmersión

TÉCNICA

1. Preparación del colorante
Mezclamos 80 ml de solución salina y 20 mL de citrato sódico al 3%.
Pesamos 1g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior.
Filtramos antes de usarlo.

2. Tinción de reticulocitos:
Es una tinción supravital, es decir, se hace mientras las células aún están vivas.
Para ello echamos  3 gotas de la solución colorante en un tubo de hemólisis y otras 3 gotas de sangre total previamente homogeneizada.
Mezclamos suavemente y tapamos con papel parafilm.
Introducimos en el baño maría a 37 ºC durante 5 min.
Pasado  este tiempo a volvemos a homogeneizar y tomamos una gota de suspensión para depositarla en un porta.
Realizamos una extensión y dejamos secar al aire.

% reticulocitos = nº de reticulocitos contados /nº d hematíes contados  x 100

Capacidad de fijación total de hierro

FUNDAMENTO

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.
El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los hematíes.
El hierro se controla, normalmente, junto con la capacidad de fijación total del hierro , y nos indica la capacidad de unión sérica disponible.

MATERIALES

R5 SOLUCIÓN SATURANTE: SOLUCIÓN DE HIERRO
R6 AGENTE PRECIPITANTE : MGNESIO CARBONATO

PROCEDIMIENTO

1. Pipetear en los tubos:
0.5 mL de muestra  y 1mL de reactivo 5
2. Mezclar bien e incubar 10 min a temperatura ambiente.
3. Añadir a cada tubo :
3 dosis de R6
4. Mezclar bien e incubar 10 min a temperatura ambiente.
5. Centrifugar 15 min  a 3000 r.p.m.
6. Recoger el sobrenadante, cuidadosamente y procesar como una muestra para la determinación del hierro.

CFTH= concentración de hierro en el sobrenadante x 3 ( factor de dilución)

VALORES DE REFERENCIA

200-400 ug/dL.

TÉCNICA DE OUCHTERLONI

FUNDAMENTO

Una placa de gel se corta para formar una serie de agujeros en el gel. Un extracto de la muestra de interés se coloca en un pocillo, y sueros o anticuerpos purificados se colocan en otro pocillo y la placa a la izquierda durante 48 horas en desarrollarse. Durante este tiempo los antígenos en el extracto de la muestra y los anticuerpos cada difundan fuera de sus respectivos pozos. Cuando los dos frentes de difusión se encuentran, si cualquiera de los anticuerpos reconocen cualquiera de los antígenos, que se unirán a los antígenos y formar un complejo inmune. El complejo inmune precipitados en el gel para dar una delgada línea blanca, que es una firma visual de reconocimiento del antígeno.

El método puede llevarse a cabo en paralelo con múltiples pozos llenos de diferentes mezclas de antígeno y múltiples pozos con diferentes anticuerpos o mezclas de anticuerpos, y la reactividad de antígeno-anticuerpo se puede ver mediante la observación de que entre los pozos se observó el precipitado. Cuando más de uno se utiliza bien hay muchos posibles resultados basados en la reactividad del antígeno y anticuerpo seleccionado. La zona de las líneas de equivalencia puede dar una plena identidad, identidad parcial, o una no-identidad.

MATERIALES

- Placas

- Gel de agarosa

- Patrón 

PROCEDIMIENTO

Preparación de agar:

https://www.youtube.com/watch?v=qzNhdHSBvjk

Tras preparar el medio de agarosa, dejar enfriar.

1. Hacer agujeros con punta de pipeta.

2.Preparar tubos A,B,CyD

3. Prepara tubo con líquido morado para hacer la prueba.

• Luego, llenamos los tubos ependorf con las distintas muestras (A,B,C,D) en el cual:

1. Tubo A: Antisuero (Anticuerpo)
2. Tubo B : Suero completo (Ag)
3. Tubo C : Albumina (Ag)

  4.  Tubo D : Ig G (Ag)

También llenamos en un tubo Ependorf para el ensayo de la placa de petri con 13 agujeros. Después de hacer el ensayo cogemos la plantilla y hacemos los agujeros a la placa de petri. Al finalizar, en las restantes placas echamos:

1. En la primera: A y B
2. En la segunda: A,B y C
3. En la tercera A,C y D

• Por ultimo, esperamos unos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego lo tapamos con parafilm y lo metemos en la estufa y a las 24 horas comprobamos  el resultado. El resultado debería de dar:

1. Placa 1 : identidad completa
2. Placa 2 : identidad parcial media
3. Placa 3 : no identidad

HEMOGLOBINA A2

FUNDAMENTO

Después de prepara un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La Hb A2 se eluye de forma específica bajo estrictas condiciones de pH y fuerca iónica, cunatificándose por lectura espectrofotométrica a 415 nm.

MATERIALES

Reactivo
Microcolumnas
Sangre
Pipeta automática
Parafilm
Gradilla
Agua destilada

PROCEDIMIENTO

1. Pipetear en un tubo de ensayo :
Sangre 50uL y agua destilada 200uL.
 Separación y lectura de la Hb A2.
2. Destapar la parte superior de la microcolumna, romper a continuación la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluido.

3. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior: hemolizado 50uL.
4.Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir, procurando arrastrar los posibles restos del mismo:
- reactivo 1: 200 uL y desechar el eluído
5. Colocar la microcolumna sobre un tubo de ensayo y añadir:
reactivo 1: 3mL y recoger el eluído.
6. Agitar bien y leer la absorbancia (A) de la fracción HbA2 a 415 nm frente a agua destilada . La absorbancia es estable al menos durante seis horas.
Lectura de la hemoglobina total.
7. Pipetear en un tubo de ensayo:
Agua destilada 12mL y 50 uL de hemolizado.
8. Agitar bien y leer la absorbancia (A) a 415nm frente a agua destilada ( Ahb total).
La absorbancia es estable al menos durante seis horas.


/CÁLCULOS:
AHbA2/AHbtotal*25= % HbA2

ABSORBANCIAS Hb total :
0.920
0.934
0.925
0.787
0.299

ABSORBANCIAS Hb A2:
0.078
0.079
0.072
0.087
0.047

ELISA

FUNDAMENTO

Tanto anticuerpos y antígenos pueden ser cuantificados cuantitativa y cualitativamente utilizando un
soporte para realizar todo este proceso.

MATERIALES
 
- Tiras de 8 pocillos con el primer anticuerpo fijado.
- Anticuerpo anti. proteína bovina marcado con peroxidasa
- Sustrato/ cromógeno
- Solución stop
- Solución de dilución del conjugado
- Micropipeta
- Frasco lavador
- Espectofotómetro












PROCEDIMIENTO

A partir de la muestra positiva, preparar tres muestras problema.
- Una dilución 1/50, mezclar 20uL de la muestra madre con 980 uL de agua destilada.
- Una dilución 1/20, mezclar 50uL de la muestra madre con 950 uL de agua destilada
- Una dilución 1/100, mezclar 10 uL de la muestra madre con 990 uL de gua destilada.

Preparación de los patrones:
Diluir los patrones 1/100 con agua destilada.
Preparación de la solución de conjugado :
Preparar solo el volumen de solución necesario para el ensayo.

PROCEDIMIENTO

1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a seer utilizadas. Guardar en la bolsa el resto de tiras. Atemperar todos los reactivos, patrones, muestras y tiras que van a ser utilizados en el ensayo.
2. Aplicar en cada pocillo de la placa 50 microL  de muestra o patrón diluído e incubar a temperatura ambiente durante 30min.
3. Eliminar el líquido de los pocillos volcando a placa sobre un recipiente.
4. Lavar cada pocillo con 0.3ml de agua destilada (*3)
5. Aplicar en cada pocillo 50 microL de solución de conjugado. Incubar a temperatura ambiente durante 30min.
6. Repetir 3 veces la secuencia de lavados como en los pasos 3 y 4.
7. Aplicar en cada pocillo 50 microL de la solución de sustrato y dejar desarrollar el color azul a 30 min a temperatura ambiente.
8 Añadir en cada pocillo 50 microL de la solución stop para parar la reacción. Mezclar dando unos golpes suaves en el borde lateral del marco.
9. Leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm.

Determinación cuantitativa de hierro IVD

FUNDAMENTO

El hierro es el constituyente de un gran numero de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado. El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxigeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropenica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina.

MATERIALES

Tubos de ensayo

Gradillas

Micropipetas

Pipetas aforadas

Pipetas automáticas

Agua destilada

Puntas de pipeta

Reactivo 1: Acetato pH 4.9

Reactivo 3: FerroZine

Reactivo 2: Ácido ascórbico

Calibrador

Cubetas

Gradillas de cubetas

Espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO

1. Ajustar espectofotómetro a 562 nm.

2. Ajustar el espectofotómetro frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta:

-Blanco RT: 1mL , 1 gota de R3, 200uL de agua destilada.

- Patrón: 1mL, 1 gota de R3, 200uL de patrón.

- Blanco de muestra: 1 mL Y 200 uL de muestra.

- Muestra: 1mL, 1 gota de R3 y 200uL de muestra.

4. Mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente.

5. Leer las absorbancias (A) del Patrón y la muestra frente al blanco de reactivo. 

CÁLCULOS:

(A) Muestra - (A) blanco de muestra /(A) <patrón * 100= ug/ dL de hierro

RESULTADOS:

Muestra mía : 0.224A

Blanco RT: 0.022A

Patrón:  0.107A

Blanco muestra: 0.010A

Muestra: 0.157A

VALORES DE REFERENCIA:

Hombres 65- 175ug/dL

Mujeres 40-150 ug/dL

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS EN CELLOGEL

FUNDAMENTO

Permite detectar las anomalías cualitativa y cualitativamente.
La hemoglobina presenta una carga global positiva o negativa que resulta de la suma de las cargas de los aminoácidos que constituyen la proteína.
Pequeños cambios en la cadena de la globina modifican la carga y en consecuencia la migración que permite detectar las anomalías.

MATERIALES

- Fuente de alimentación
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Tiras de acetato de celulosa.
- Cloroformo para la preparación del hemolizado
- Suero fisiológico
- Tampón
- Colorante rojo ponceau
- Decolorante rojo ponceau
- Solución transparentadora





PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO

Se recoge 1 mL sangre con anticoagulante.
Se centrifuga a 3000 r.p.m durante 5 min.
Se elimina el plasma con ayuda de una pipeta pasteur.
Se hace una nueva suspensión de los hematíes con 4-5 mL de suero fisiológico 3 veces
Se hemolizan los hematíes en un tubo de vidrio:
-1 vol. de hematíes
- 1.5 vol. de agua destilada
- 0.5 vol. de cloroformo

Agitar fuertemente. Centrifugar 20 min a 3000 r.p.m. El sobrenadante se emplea para la electroforesis una vez efectuada la dilución adecuada. Para ello se valora la hemoglobina y de acuerdo con el resultado se prepara una solución de Hb 5 g/100 mL diluyendo con agua destilada.

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir las tiras en tampón duarante 10 min. como mínimo.
2. Absorber el exceso de tampón de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.
3. Constatar que sea la cara absorvente de las tiras  mediante la esquina cortada, ésta debe quedar orientada hacia el operador, hacia la derecha y abajo.
4. Montar las tiras sobre el puente .
5. Migraciones:
Semi- micro electroforesis: 90 min a 200 volts. Efectuar la aplicación a 1.5 cm del borde catódico.
6. Fin de la migración. Desconectar el alimentador y las cubetas.
7. Es muy importante ponerla en contacto con la superficie de tinción durante 10 min.
8. Decoloración: 3-4 lavados.
9. Transparentador: 2-3 min.
Para rojo ponceau disolver en ácido acético. y lectura a 520.

RESISTENCIA ÓSMOTICA ERITROCITARIAS

FUNDAMENTO

Someter a los hematíes a distintas soluciones salinas hipotónicas de concentración creciente determinado, a continuación, el grado de hemólisis en cada una de ellas. En condiciones normales, yy empleando sangre sin incubar, la hemólisis se inicia a la concentración de NaCl de 5.5 g/L y es prácticamente total a la de 3 g/L.



MATERIALES

- Agua destilada
- Solución salina 0.9 %
- Pipeta de 10 mL
- Puntas de pipeta
- Centrífuga
- Tubos de ensayo
- Centrífuga
- Gradilla
- Sangre venosa anticogulada
- Papel de parafina



PROCEDIMIENTO

1. Preparar 5 tubos de soluciones con diferentes concentraciones.
2. La solución preparada sera de 10 mL por lo tanto calculamos la cantidad de solución madre que tendremos que poner dependiéndo de la concentación requerida.

TUBO 4 : 10 ml de agua destilada ( 0%)
TUBO 3 : 2.22 mL de solución madre + 7.88 mL de agua destilada (0.2%)
TUBO 2 : 3.88 mL de solución madre + 6.22 mL de agua destilada (0.35%)
TUBO 1 : 6.1 mL de solución madre + 3.9 mL d agua destilada ( 0.55%)
TUBO 0 : 10 mL de solución madre ( 0.9%)






RESULTADOS:

HEMÓLISIS EN EL TUBO DE CONCENTRACIÓN 0.55%.

HEMOGLOBINA. DRABKIN. COLORIMETRICO

FUNDAMENTO

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

REACTIVOS

Hemoglobin: Ferricianuro de potasio - 0.60 mmol/L
Cianuro de potasio 77 mmol/L
Dihidrógeno fosfato de potasio 2 mmol/L

OPCIONAL

Hemoglobin CAL: Patrón de hemoglobina 15g/dL
Origen animal.

PREPARACIÓN REACTIVO DE TRABAJO ( RT) :
 Para 5 mL   4.9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo.
Para 250 mL agua destilada + 1 frasco ( 5mL) de reactivo.

MATERIAL ADICIONAL
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas de 540 nm.
- Cubetas de 1.0 cm  de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.

MUESTRAS

Sangre capilar o venosa.
Usar anticoagulante como EDTA, heparina u oxalato.
Estabilidad de la muestra : 1 semana a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO

1. A justa longitud de onda del espectrofotómetro 540nm.
Y  también ajustar temperatura 15-25ºC.
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear:
 Método macro.

Blanco: 5.0 mL de RT
Patrón: 5.0 mL de RT y  20 uL de calibrador.
Muestra: 5.0 RT y 20 uL muestra.

CÁLCULOS:

A MUESTRA/A PATRÓN X 15= g/ dL de hemoglobina en la muestra.

VALORES DE REFERENCIA:

Hombres; 14-18 g/dL
Mujeres: 12-16 g/dL

RESULTADOS:

Blanco: 0.000A
Patrón; 0.440A
Muestra: 0.222A

0.222/0.440x 15 = 7.56 g/dL hemoglobina en la muetra.

2 RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

FUNDAMENTO:

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada, Es un método poco usado debido al elevado error que presenta, La técnica consiste en diluir sangre anticoagulada con EDTA, en líquido de Turck, con una pipeta de dilución y el recuento de las células medinte hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico. Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución utilizada, el áre contada y la altura de la cámara utilizada.

MATERIAL Y REACTIVOS

- Microscopio
- Pipetas de 20 ul o pipetas de Thoma
- Cámara de Neubauer
- Sangre anticoagulada
- Papel de filtro
- Líquido de Turck. La composición del líquido de Turck es la siguiente:
* 2 ml de ácido acético glacial
* 1 ml de solución acuosa de violeta genciana al 1 %
* 100 ml de agua destilada

El ácido acético provoca la lisis de los hematíes sin que se alteren los leucocitos. El violeta de genciana tiñe ligeramente de azul el núcleo de los leucocitos mejorando la observación.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar un tubo con 0.38 ml de líquido de Turck ( = 380 uL)
2. Con una micropipeta de 20 ul, pipetemos la sangre, limpiamos la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa de papel de filtro sin arrastrar sangre del interior y la ponemos en el tubo de ensayo con el diluyente, En la parte superior del tubo se lava varias veces con diluyente en el interior de la punta de pipeta para arrastra bien la sangre.
3. Tapar el tubo de ensayo con papel de parafina y se mezcla suavemente.
4. Montar la cámara.
5. Llenar la cámara por capilaridad. ( Debe llenarse de forma que el líquido ocupe toda su superficie).
6. Dejar que repose durante 5', para que sedimenten los leucocitos.
7. Con el objetivo de 10x enfocamos , con el de 20x se observa la distribución de las células .
8. Enfocar con 40x. Contar los leucocitos presentes en 16 cuadros , de los 4 cuadros grandes situados en las esquinas de la cámara.
9. No contar partículas extrañas ni pequeñas burbujas. Para realizar un recuento correcto y no contar leucocitos por segunda vez, si existen células sobre los bordes exteriores de un cuadrado, se cuentan solo aquellos situados sobre las líneas superior y derecha y no se cuentan los que están situados en las líneas inferior e izquierda.
10. Calcular la cifra de leucocitos de la muestra ( expresado en leucocitos por mm3 de sangre) teniendo en cuenta la dilución realizada y el volumen de los cuadros.

RESULTADOS:

Cuadro superior derecho: 45
Cuadro superior izquierdo: 48
Cuadro inferior izquierdo: 36
Cuadro inferior derecho: 55
184x50= 9200

2 RECUENTO DE HEMATÍIES

FUNDAMENTO

Se basan en la dilución de la sangre total capilar o anticoagulada con EDTA, en líquido de Hayem, con una pipeta de dilución y el recuento de las células mediante hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico. Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución utilizada, el área contada y la altura de la cámara utilizada.
El líquido de Hayem contiene cloruro sódico para que sean isotónicos y evitar hemólisis, e incorpora citrato sódico como anticoagulante y un antiséptico como la formalina.

MATERIAL Y REACTIVOS

- Microscopio
- Pipetas de 20 ul o pipetas de Thoma
- Cámara de Neubauer
- Sangre anticoagulada
- Papel de filtro
- Líquido diluyente de Hayem

TÉCNICA

1.Preparar un tubo con 3.98 ml de líquido de Hayem.

2. Con una micropipeta de 20 ul, pipeteamos la sangre, limpiamos la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa sin arrastrar sangre del interior y la ponemos en el tubo de ensayo con el diluyente. En la parte superior del tubo se lava varias veces con diluyente el interior de la punta de pipeta para arrastrar bien la sangre.
3. Tapar el tubo de ensayo con papel de parafina y se mezcla suavemente por inversión.
4. Montar la cámara.
5. Llenar la cámara por capilaridad. ( Tener cuidado de llenarla lo suficiente para que ocupe toda su superficie).
6. Dejar que repose durante 3 min en cámara húmeda, para que sedimenten los  hematíes. 
7. Con el objetivo de 10x enfocamos, con el 20x se observa la distribución de las  células ( si no están uniformemente distribuídos debemos repetir la técnica) y el recuento lo hacemos con el de 40x.
8. Contaremos 5 cuadros, del los 25 situados en el medio de la cámara que se divide cada uno en 16 cuadros. Contaremos los 4 de las esquinas y el central.
9. Contar solo aquellos hematíes situados sobre la línea superior y derecha.
10. Calcular la cifra de hematíes de la muestra ( expresado en eritrocitos por mm3 de sangre) teniendo en cuenta la dilución realizada y el volumen de los cuadros contados.

Nº de hematíes contados en los cinco cuadros x 10.000

RESULTADOS:

Cuadro superior izquierdo: 103
Cuadro superior derecho: 102
Cuadro central:112
Cuadro inferior izquierdo: 110
Cuadro inferior derecho: 110


537x10000= 5370000