INMUNODOTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES

PRINCIPIO

La prueba se basa en el principio de enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP;dicho conjugado va dirigido contra la Ig G / Ig M humanas. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP. desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. DIcha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

MATERIALES

- Puntas de pipeta
- Probeta
- Pipetas
- Agua destilada
-  Vaso de precipitado
- Agitador
- Prepipeta
- Pipeta manual

Contenido del kit:
1 .- Para ser diluído:
- Tampón de lavado concentrado 10x ( 1x40ml): Tapón incoloro.

2.- Listo para usar:
- Tira dot
- Tampón de dilución ( 1x40mL): Tapón azul.
- Sustrato ( 1x40mL): Bote marrón.
- Bandejas de incubación : 3 unidades.




Antes de comenzar atemperar todos los reactivos y diluir el tampón de lavado ( 15 mL por tira: 1.5 mL de tampón de lavado 10x + 13.5 mL de agua destilada).

PROCEDIMIENTO:

1. Colocar una tira por paciente en el canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.

2. Añadir 2mL de tampón de lavado en cada canal usado. Incubar 10 minutos en agitación. Tras una correcta incubación, los puntos azules de la tira desaparecen por completo; si no es así, continuar con el procedimiento hasta que lo hagan.

3. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.

4. Añadir 1.5 mL de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados.

5. Añadir 10 uL de muestra del paciente por canal. Incubar 30 minutos en agitación. Se debe evitar tocar la membrana con las puntas de las pipetas. La muestra se debe dispensar sobre la parte superior de la tira ( zona de la etiqueta de plástico).

6. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.




















7. Lavar tres veces cada canal utilizado ( durante 2 minutos cada vez) con 1.5 mL de tampón de lavado. Agitar durante el lavado. Después de cada lavado, eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.

8. Añadir 1.5 mL de conjugado por canal utilizado. Incubar 30 minutos en agitación.

9. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.

10. Lavar tres veces cada canal utilizado ( 3 minutos cada vez) con 1.5 mL de tampón de lavado. Agitar durante el lavado. Después de cada lavado, eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.

11. Añadir 1.5 mL de sustrato por canal utilizado. Incubar 10 minutos en agitación.

12. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.

13. Lavar una vez más ( durante 3 minutos) con 1.5 mL de tampón de lavado para detener la reacción.

14. Extraer las tiras de los canales y dejarlas secar en papel absorbente.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

1. Despegar la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocar dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación proporcionada en el kit. Este indicará las posiciones respectivas de los diferentes controles y antígenos en a membrana.
2. El punto superior ( control +) debe aparecer coloreado en todos los paciente. Solo un punto de control de reacción claramente positiva asegura que los resultados son válidos, que la prueba, se desarrolló correctamente y/o los reactivos no se han degradado.
3. En condiciones óptimas ,  y si la muestra está libre de sustancias que interfieran, el control - ( el punto inferior) será incoloro. La aparición de color en el punto de control negativo indica la existencia de uniones inespecíficas debidas a sustancias con capacidad de interferiri y que están presentes en la muestra.
4. Comparar el punto correspondiente a cada antígeno específico con el punto de control -.
- Resultado +: una muestra es positiva para un Ac específico si la intensidad del punto correspondiente a su Ag es mayor que la intensidad de color del control negativo.
- Resultado -: una muestra es negativa para un Ac específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o igual que la intensidad de color del control - .