BILIRRUBINA TOTAL ( DMSO. COLORIMÉTRICO)

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero bilirrubin-glucurónico y bilirrubina  libre ligada a la albúmina, solo la primer reacciona en medio acuoso ( bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con dimetilsulfóxido ( DMSO) para que reaccione ( bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa correspondiente el resutado a la bilirrubina total.


SIGNIFICADO CLÍNICO

 La bilirrubina se origina la degradación de la hemoglobina.
Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis.
La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia:

- Bilirrubina total: aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.
- Bilirrubina directa: colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.




MATERIALES

- Tubos de ensayo
- Pipeta
- Puntas de pipeta
- Gradilla
- Cubetas
- Gradilla de cubetas
- R1 ( Ácido sulfanílico, ácido clorhídrico y dimetilsulfóxido)
- R2 ( Sodio nitrito)
- Suero
- Espectrofotómetro




















PROCEDIMIENTO

1) Condiciones de ensayo:
- Longitud de onda : 555 nm
- Temperatura: 15-25 ºC
2) Ajustar espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3) Pipetear en una cubeta:
- Blanco: 1.5 mL ( R1) + 100 uL ( muestra/calibrador)
- Bilirrubina total: 1.5 mL ( R1) + 50 uL ( R2) + 100 uL ( muestra/calibrador)

4) Mezclar e incuar exactamente 5 minutos a 15-25 ºC.
5) Leer la absorbancia.

RESULTADOS
Absorbancia: 0.105 nm

Bilirrubina total: absorbancia muestra - absorbancia blanco muestra x factor ( 22) = mg/dL bilirrubina en la muestra; 0.105 - 0 x 22 = 2.3mg/ dL bilirrubina total.
Bilirrubina libre : absorbancia bilirrubina total - absorbancia bilirrubina directa; 2.3 mg/ dL - 1.19 mg/ dL = 1.11 mg/dL.

Valores de referencia según el protocolo : hasta 1.10 mg/ dL.

Sensibilidad analítica : 1 mg / dL.

BILIRRUBINA DIRECTA

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose fotometricamente. De las dos fracciones presentes en suero bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, solo la primera reacciona en medio acuoso ( bilirrubina directa) precisando la segunda solubilización con dimetilsulfóxido para que reaccione ( bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiente el resultado a la bilirrubina total.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada. 

SIGNIFICADO CLÍNICO

La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina.

Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis.

La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia:
- Bilirrubina total: aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.
- Bilirrubina directa: colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.

MATERIALES


- Cubetas
- Puntas de pipeta
- Gradilla
- Pipeta automática
- Gradilla para cubetas
- Reactivo 1 ( Ácido sulfanílico y ácido clorhídrico)
- Reactivo 2 ( Sodio nitrito)
- Suero
- Tubos de ensayo
- Espectrofotómetro
- Agua destilada

PROCEDIMIENTO

1)  Ajustar espectrofotómetro:
Longitud de onda: 555 nm
Temperatura: 15-25 ºC
2) Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3) Pipetear en una cubeta:
Blanco: 1.5 mL R1 + 100 uL de muestra/calibrador
Bilirrubina directa: 1.5 mL R1 + 50 uL R2 + 100 uL de muestra/calibrador

4) Mezclar e incubar exactamente 5 min a 15-25 ºC.
5) Leer la absorbancia.

RESULTADOS:

A = 0.085 nm
Bilirrubina directa = 0.085-0 x 14 = 1.19 mg/dL

Sensibilidad analítica: 1mg/dL
Bilirrubina directa : hasta 0.25mg/dL

TEST PARA SANGRE OCULTA EN HECES

USO PREVISTO

El test NADAL FOB es un inmunoensayo visual rápido para la detección cualitativa de hemoglobina humana en muestras fecales. Diseñado para el diagnóstico profesional de enfermedades en el intestino grueso.

FUNDAMENTO

El test NADAL FOB ha sido diseñado para detectar hemoglobina humana a través de la interpretación visual del cambio de color del test.

Los anticuerpos contra la hemoglobina humana se quedan inmovilizados en la zona de la línea de prueba de la membrana. Durante la prueba, la muestra reacciona con los anticuerpos contra la hemoglobina humana, que están unidos a unas partículas de color que recubren la superficie absorbente. Esta mezcla se desplaza a lo largo de la membrana mediante acción capilar e interactúa con los componentes de esta. Si hay suficiente cantidad de hemoglobina en la muestra , se formará una línea de color en la zona de lectura de la membrana, indicando un resultado positivo. En caso de ausencia de hemoglobina humana en la muestra extraída , no aparecerá ninguna línea en el área de lectura, por lo tanto el resultado será negativo. En la zona de control debe siempre aparecer una línea, que actúa como mecanismo de control, indicando que la cantidad de muestra ha sido suficiente y que el test se ha realizado correctamente.

MATERIALES 

- Tubo recolector de muestras con búfer diluyente.

- Casete de test envasado individualmente.

- Muestra ( heces).

PROCEDIMIENTO

1) Sacar el dispositivo de su envoltorio y colocar sobre una superficie limpia y plana. Sujetar el tubo verticalmente y abrir el tapón azul. Extraer el aplicador, procurar evitar cualquier derrame o salpicadura del búfer desde el tubo recolector.
- Recolectar la muestra introduciendo el aplicador en tres puntos diferentes de las heces.

2) Agitar bien el tubo de recolección para que la muestra se mezcle completamente con el búfer diluyente.

3) Desenroscar la tapa blanca protectora del tubo de recolección. Romper la punta del dispositivo mediante un movimiento giratorio utilizando un pañuelo de papel.

Mantener el tubo recolector de forma vertical y añadir 3 gotas de la solución en el pocillo de prueba. Evitar que queden burbujas atrapadas en el pocillo de prueba y no añada ninguna solución       en el área de lectura.


5) Interpretar resultado a los 5 minutos. No interpretar transcurridos 10 minutos.

Resultado positivo : las dos líneas coloreadas

Resultado negativo: Solo se colorea la línea control ( test de la derecha)

OBSERVACIÓN DE HECES

INTRODUCCIÓN

La investigación de los principios inmediatos que aparecen digeridos en las heces debe realizarse a nivel macroscópico y microscópico.

En una primera etapa, se realiza un análisis a simple vista de las hece, extendiéndo una porción de a muestra sobre una placa de Petri y observando su consistencia, color, olor, y forma. Buscamos tamién trozos de carne, fragmentos de fécula, grasas neutras, moco, pus y sangre que puedan darnos alguna indicación de anormalidad en la digestión.

Es importante tener e cuenta la existencia de elementos que pueden entorpecer este análisis, como es la presencia de artefactos( trozos de papel o chicles que tragan loa niños) o restos alimenticios difícilmente digeribles ( cubiertas plásticas de embutidos, restos vegetales, etc..)

Despúes del análisis macroscópico, realizamos el microscópico, según la técnica descrita a continuación.

Para un correcto análisis, es conveniente que el paciente siga una dieta normal, pero indicándole que debe contener todos los principios inmediatos: grasas, proteínas e hidratos de carbono. Esto lo hará como mínimo durante dos días seguidos y la muestra se recogerá al tercer día.

PROCEDIMIENTO

Fundamento

En las heces podemos observar con facilidad el grado de digestión de los distintos principios inmediatos, de modo que este examen microscópico es de gran ayuda en el diagnóstico de los distintos tipos de patologías relacionadas con el proceso de digestión.

Material necesario

- Espátula o depresor lingual de madera desechable
- Portaobjetos y cubreobjetos.
- Microscopio óptico.
- Mechero.
- Agua destilada
- Sudán III
- Gradilla
- Matraz Erlenmeyer
- Lugol
- Ácido acético
- Filtro
- Espátula
- Vórtex
- Etanol 96º
- Balanza analítica
- Pipeta Pasteur
- Heces





















TÉCNICA

1) Preparación de 0.5 gramos de Sudán IIIb+ 45 mL de etanol 96º. A continuación calentar y filtrar.

2) Preparamos 0.2 gramos de Sudán III + 10 mL de etanol 96º + 90 mL de ácido acético.

3) Preparamos tubos con Lugol.

4) Depositamos en un tubo de centrifuga 10 mL de agua destilda con un poco de heces.

5) Mezclamos y agitamos con el vórtex.

6) Utilizamos cuatro portas y en cada uno depositaremos lo siguiente:

- Primer porta : 1 gota de inóculo y 1 gota de lugol.
- Segundo porta: 1 gota de inóculo y 1 gota de Sudán III. Calentar un poco.
- Tercer porta: 1 gota de inóculo y 1 gota de Sudán III con acético.
- Cuarto porta: 1 gota de inóculo.

7) Observar al microscopio.

Almidón parcialmente digerido

Gotas de grasa de color anaranjado teñidas con Sudán III y ácido acético.

Fibra vegetal ( Sudán III)

                                                                                                   Pelo vegetal en fresco

Fibra cárnica mal digerida


1. En el porta con lugol observamos el estado de digestión de los hidratos de carbono y de las proteínas.

Los hidratos de carbono en forma de almidón que se tiñe de color azul-violeta o negro, lo que es indicativo de una mala digestión.

Las proteínas se tiñen de color amarillo-pardo y cuando están bien digeridas se aprecian como restos de contornos redondeados sin estrías. Si proceden de tejido muscular estriado y están mal digeridas, podremos observar trozos grandes con estrías longitudinales y transversales, e contornos irregulares o bordes angulosos, y de color marrón oscuro.

2. En el porta caliente con Sudán III podemos observar la presencia de grasas neutras y ácidos grasos, que se tiñen de rojo y aparecen como glóbulos de color rojo-anaranjado, que se transforman en espículas a medida que se enfría la preparación.

3. En el porta caliente con la solución de Sudán III y ácido acético observaremos la presencia de jabones , que se verán como agujas o placas de cristales afilados.

4. Además podemos observar restos vegetales no digeribles, pelos, haces vasculares vegetales con vasos anillados , células petreas, etc..