PRÁCTICA 11: TINCIONES POLICROMAS

FUNDAMENTO:

Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos

 que conducen a la coloración de las estructuras que 

componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el

 aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que

 las rodea, y permite por tanto que las células sean visual 

izadas microscópicamente con mayor facilidad.

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se

 practican sobre células que están vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre

 células que están vivas, mediante la introducción de un 

colorante en la circulación de un organismo vivo. Son 

colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de

 metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre

 células o tejidos vivos, pero que están aislados del 

organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se 

realizan sobre células muertas. La coloración de células 

muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por

 objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas 

firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijación puede

 realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza 

con etanol o metanol.

Las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes 

que con frecuencia derivan de la anilina.

• Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las 
• estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la
•  hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.
• 
  

• Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las
•  estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los 
• ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.
• 
  
• Dependiéndo de la forma en la que se tiñen las 
• granulaciones plasmáticas podemos clasificar los elementos
•  de una fórmula leucocitaria en :
• - Los elementos que se tiñen con eosina ( colorante ácido),
•  se determinar eosinófilos.
• - Los elementos que se tiñen de azul de metileno ( colorante
•  básico) , se denominan basófilos.
• - Los elementos que se tiñen con eosinato- azul de metileno 
• ( colorante neutro) se denominan neutrófilos.
• Cuando se emplean colorantes que van en solución 
• alcohólica no es necesario fijar la preparación, en cambio 
• cuando se utilizan colorantes que van en solución acuosa, lo 
• primero es fijarla, y para ello se hace pasar el frotis por una 
• de estas sustancias:
• - Alcohol etílico durante 10-12 min.
• - Alcohol metílico durante 3- 5 min.
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• 
  
• TINCIÓN DE GIEMSA
• FUNDAMENTO
• Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul
  De este modo, obtenemos una tinción diferencial, es decir,
•  de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y
•  azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la
•  eosina como colorante ácido.
•  una tinción que es capaz de discriminar entre las distintas
•  estructuras celulares según se tiñan éstas con el colorante
•  ácido, con el básico o con la mezcla de ambos.
• Está tinción utiliza una combinación de colorantes que da
•  lugar a una tinción policroma.

• MATERIAL
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• - Un frotis con sangre
• 
• - Agua destilada
• -Cubeta de tinción
• - Pipeta Pasteur
• - Tubo de ensayo
• - Gradilla
• - Paralelas
• - Colorante Giemsa ( contiene azul 
• de metileno, eosina y
•  azur II).
• TÉCNICA
• 1. Se colocan los portas con sangre una vez seca, sobre las
•  paralelas colocadas en una cubeta de tinción con el lado de
•  la extensión hacia arriba.
• 2. Se fijan con el alcohol metílico durante 5' cubriendo bien
•  toda la preparación, ayudándonos con una pipeta Pasteur.
• 3. Se escurre el exceso  de alcohol y se deja secar al aire.
• 4. Se bañan los portas con abundante cantidad de colorante
•  diluido que hemos preparado en el el tubo de ensayo con 9 
• gotas de Giemsa por cada 3ml de agua destilada y se deja
•  30'.
• 5. Se lavan los portas con abundante agua destilada.
• 6. Se limpia el dorso de los portas con un trozo de gasa 
• limpia para eliminar cualquier resto de colorante.
• 7. Se deja secar al aire libre.
• 8. Se observa al microscopio.
• 
  
• Observaciones:

Colocamos el porta con la sangre una vez seca encima de las paralelas con el lado de la tinción hacia arriba. Fijamos con alcohol metílico y dejamos reposar durante minutos. Escurrimos y dejamos secar la preparación al aire libre.

A continuación preparamos la disolución en un tubo de ensayo con 9 gotas de Giemsa por cada 3 mL de agua destilada y mezclamos bien todo hasta que quede homogeneizado ayudándonos de parafilm para tapar el tubo de ensayo y que no se derrame nada.

Cubrimos los portas con la disolución preparada y lo dejamos reposar durante 30 minutos.

Finalmente, lavamos los portas con abundante agua destilada , limpiamos el dorso de estos con una gasa limpia, se deja secar al aire y observamos al microscopio.

TINCIÓN DE MAY-

GRUNDWALD-GIEMSA


MATERIAL

- Un frotis con sangre.

- Agua destilada

- Cubeta de tinción

- Pipeta Pasteur

- Tubo de ensayo

- Gradilla

- Paralelas

- Solución de May-Grundwald


TÉCNICA

1.La preparación secada al aire, pero sin fijar, se cubre 

durante 3 minutos con solución May-Grundwald.

2. Sin quitar el colorante, diluir, añadiéndo igual volumen de

 agua destilada que el que se haya puesto de colorante,

 procurando que este no se vierta. Dejar actuar durante 5 

minutos.

3. Inclinar el porta para que se vierta y escurra el colorante,

sin lavar, cubrir con solución de Giemsa diluida ( 5 gotas en

 5 ml). Dejar actuar durante 15 min.

4. Lavar con agua destilada y secar.




5. Examinar al microscopio con el objetivo de 100x.

PANÓPTICO RÁPIDO


MATERIAL

- Un frotis con sangre humana

- Tres cubetas de wertheim

- Agua destilada

- Pinzas

- Solución 1: Metanol ( fijador)

- Solución 2: Santeño ( ácido)

- Solución 3: Tiacina ( básico)

- Lancetas

- Algodón

- Alcohol

- Microscopio


TÉCNICA

1. Preparadas las extensiones del modo habitual se dejan

 secar al aire.



2. Se colocan las tres soluciones de Wertheim, una cubeta 

por cada solución.


3. Cogemos los portas y los sumergimos 5'' en la solución 1, 

2 y 3.


4. Se lavan con agua destilada y se dejan secar sobre papel

 secante para que absorba el el exceso de agua.


5. Cuando esté totalmente seca procedemos a su 

observación en el microscopio.

TINCIÓN DE  WRIGHT

TÉCNICA

1. La preparación secada al aire, pero sin fijar, se cubre con la solución de Wright, durante 1 o 2 min.

2. Se añade la misma cantidad de agua destilada, sin quitar el colorante, y se deja actuar durante 4 o 5 min.

3. Lavar la extensión con agua destilada hasta que tome un color rosado. No se debe volcar el portaobjetos para eliminar el colorante antes de haberlo lavado bien con el agua para evitar que se deposite sobre la preparación quedando restos de él.

4. Limpiar la parte posterior de la preparación con una gasa humedecida en alcohol.

5. Secar al aire.

6. Examinar al microscopio con el objetivo de 100x.

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• 
  

PRÁCTICA 8: RECUENTO MANUAL HEMATÍES

FUNDAMENTO

Se basan en la dilución de la sangre total capilar o anticoagulada con EDTA, en líquido de Hayem, con una pipeta de dilución y el recuento de las células mediante hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico. Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución utilizada, el área contada y la altura de la cámara utilizada.
El líquido de Hayem contiene cloruro sódico para que sean isotónicos y evitar hemólisis, e incorpora citrato sódico como anticoagulante y un antiséptico como la formalina.

MATERIAL Y REACTIVOS

- Microscopio
- Pipetas de 20 ul o pipetas de Thoma
- Cámara de Neubauer
- Sangre anticoagulada
- Papel de filtro
- Líquido diluyente de Hayem

TÉCNICA

1.Preparar un tubo con 3.98 ml de líquido de Hayem.

2. Con una micropipeta de 20 ul, pipeteamos la sangre, limpiamos la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa sin arrastrar sangre del interior y la ponemos en el tubo de ensayo con el diluyente. En la parte superior del tubo se lava varias veces con diluyente el interior de la punta de pipeta para arrastrar bien la sangre.
3. Tapar el tubo de ensayo con papel de parafina y se mezcla suavemente por inversión.
4. Montar la cámara.
5. Llenar la cámara por capilaridad. ( Tener cuidado de llenarla lo suficiente para que ocupe toda su superficie).
6. Dejar que repose durante 3 min en cámara húmeda, para que sedimenten los  hematíes. 
7. Con el objetivo de 10x enfocamos, con el 20x se observa la distribución de las  células ( si no están uniformemente distribuídos debemos repetir la técnica) y el recuento lo hacemos con el de 40x.
8. Contaremos 5 cuadros, del los 25 situados en el medio de la cámara que se divide cada uno en 16 cuadros. Contaremos los 4 de las esquinas y el central.

9. Contar solo aquellos hematíes situados sobre la línea superior y derecha.

10. Calcular la cifra de hematíes de la muestra ( expresado en eritrocitos por mm3 de sangre) teniendo en cuenta la dilución realizada y el volumen de los cuadros contados.

Nº de hematíes contados en los cinco cuadros x 10.000


RESULTADOS 

Cuadrado superior izquierdo: 53
Cuadrado superior derecho: 41
Cuadrado inferior izquierdo: 44
Cuadrado inferior derecho: 37
Cuadrado central: 54

229 x 10000 = 2.290.000

  

PRÁCTICA7: RECUENTO MANUAL DE LEUCOCITOS

FUNDAMENTO:

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada, Es un método poco usado debido al elevado error que presenta, La técnica consiste en diluir sangre anticoagulada con EDTA, en líquido de Turck, con una pipeta de dilución y el recuento de las células medinte hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico. Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución utilizada, el áre contada y la altura de la cámara utilizada.

MATERIAL Y REACTIVOS

- Microscopio
- Pipetas de 20 ul o pipetas de Thoma
- Cámara de Neubauer
- Sangre anticoagulada
- Papel de filtro
- Líquido de Turck. La composición del líquido de Turck es la siguiente:
* 2 ml de ácido acético glacial
* 1 ml de solución acuosa de violeta genciana al 1 %
* 100 ml de agua destilada

El ácido acético provoca la lisis de los hematíes sin que se alteren los leucocitos. El violeta de genciana tiñe ligeramente de azul el núcleo de los leucocitos mejorando la observación.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar un tubo con 0.38 ml de líquido de Turck ( = 380 uL)
2. Con una micropipeta de 20 ul, pipetemos la sangre, limpiamos la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa de papel de filtro sin arrastrar sangre del interior y la ponemos en el tubo de ensayo con el diluyente, En la parte superior del tubo se lava varias veces con diluyente en el interior de la punta de pipeta para arrastra bien la sangre.
3. Tapar el tubo de ensayo con papel de parafina y se mezcla suavemente.
4. Montar la cámara.
5. Llenar la cámara por capilaridad. ( Debe llenarse de forma que el líquido ocupe toda su superficie).
6. Dejar que repose durante 5', para que sedimenten los leucocitos.
7. Con el objetivo de 10x enfocamos , con el de 20x se observa la distribución de las células .
8. Enfocar con 40x. Contar los leucocitos presentes en 16 cuadros , de los 4 cuadros grandes situados en las esquinas de la cámara.
9. No contar partículas extrañas ni pequeñas burbujas. Para realizar un recuento correcto y no contar leucocitos por segunda vez, si existen células sobre los bordes exteriores de un cuadrado, se cuentan solo aquellos situados sobre las líneas superior y derecha y no se cuentan los que están situados en las líneas inferior e izquierda.
10. Calcular la cifra de leucocitos de la muestra ( expresado en leucocitos por mm3 de sangre) teniendo en cuenta la dilución realizada y el volumen de los cuadros.

RESULTADOS


Volumen contado: 0.5 mm3
Dilución utilizada: 1:20
Leucocitos contados: 79
Leucocitos mm3: 79 x 50 = 3950